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Cromatografía

Diferentes tipos de técnicas de cromatografía

La técnica de cromatografía es uno de los métodos más potentes para separar una muestra, como una mezcla sintetizada o un extracto crudo biológico, en sus componentes individuales. La técnica de separación mediante cromatografía se basa en sustancias que se dividen en dos fases: una fase estacionaria con una gran superficie y una fase móvil que se desplaza hasta la fase estática. 

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Los tipos de cromatografía que se utilizan con más frecuencia son la cromatografía de gases o la cromatografía de líquidos. La diferencia está relacionada con el estado físico de la fase móvil en la cromatografía de columna. En la cromatografía de gases, la fase móvil es un gas que transporta la muestra a través de una fase estática estacionaria sólida, mientras que en la cromatografía de líquidos la fase móvil es un disolvente. La interacción de los compuestos con la fase estacionaria, un proceso conocido como el modo de separación, se controla mediante las diferencias en polaridad, tamaño o afinidades de unión específicas. El modo de separación del método de cromatografía determina el tipo de técnica de la cromatografía de líquidos (Tabla 1). 

Tabla 1. Tipos de cromatografía de líquidos 
Tipos de cromatografía de líquidos  Modo de separación de cromatografía basado en: 
Cromatografía de adsorción (cromatografía normal y de fase inversa)  Polaridad
Cromatografía de afinidad  Interacción de unión específica 
Cromatografía de exclusión por tamaño  Tamaños moleculares 
Cromatografía de intercambio iónico  Carga

Flujo de trabajo de purificación de la cromatografía

La cromatografía en columna de adsorción es la parte principal de un flujo de trabajo típico de aislamiento y purificación de medicamentos, productos químicos, sabores y otros. Al principio, las sustancias se sintetizan químicamente o se extraen de plantas, bacterias u otros organismos vivos. La evaporación se usa para concentrar el material con la finalidad de simplificar el procesamiento de flujo descendiente. Si la muestra es nueva y no se reconoce, se realiza un proceso de detección para encontrar las condiciones de separación óptimas de la cromatografía, normalmente mediante los métodos de cromatografía de capa fina (TLC por sus siglas en inglés) o de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC por sus siglas en inglés) analítica. Una vez encontradas las condiciones adecuadas, el proceso cromatográfico se escala para realizar la cromatografía preparativa. En el paso de preparación, el compuesto objetivo se purifica en altas cantidades mediante cromatografía flash, HPLC preparativa o una combinación de ambas. Si se usan las técnicas juntas, se aplica la cromatografía flash para el paso de pre-purificación y la HPLC preparativa para conseguir una alta pureza final. Tras separar los componentes correctamente, se realiza un segundo paso de concentración por evaporación o liofilización. En ese momento, el compuesto estará listo para que se analice su pureza y función mediante otras técnicas, incluyendo el análisis del punto de fusión, la HPLC analítica, los ensayos enzimáticos y otros.

El flujo de trabajo completo tras la síntesis o la extracción se muestra en la Figura 1.

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Figura 1. Flujo de trabajo de purificación de un flujo de trabajo general de extracción o síntesis

 

La cromatografía en columna de adsorción fue la primera forma de cromatografía de líquidos. La descubrió hace más de 100 años Mikhail Tsvet, un botánico italo-ruso que utilizó este tipo de proceso cromatográfico para separar los pigmentos de las plantas. Desde entonces, la técnica de cromatografía se ha desarrollado con mucha rapidez y se ha convertido en un método esencial utilizado en laboratorios de síntesis y extracción.  

En la cromatografía de adsorción, la separación se controla mediante las interacciones de los componentes de la muestra con la fase estacionaria y la fase móvil. Los compuestos con diferentes propiedades químicas (polaridades) muestran diferentes afinidades, o fuerzas de adhesión, hacia la fase móvil y la fase estacionaria. La afinidad está influenciada por dos propiedades moleculares: la adsorción y la desorción. La adsorción hace referencia a la capacidad de un componente concreto para adherirse a la fase estacionaria. La desorción o solubilidad, describe la capacidad de un componente de la mezcla para disolverse en la fase móvil. La velocidad a la que migran los componentes individuales de la muestra a través de la fase estacionaria depende de sus propiedades de adsorción/desorción, como se muestra en la Figura 2. 

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Figura 2. Adsorción frente a desorción  

 

Cromatografía flash frente a la técnica de HPLC preparativa

A finales de la década de 1970, apareció la primera publicación en la que se usaba la presión elevada con un método llamado cromatografía flash. Además de esto, se intentó aumentar el tamaño de los sistemas de HPLC analítica y, de esa forma, podían usarse también para la cromatografía preparativa (HPLC preparativa). En la actualidad, las dos técnicas se usan con frecuencia, pero con objetivos diferentes. La cromatografía flash se usa principalmente como paso de pre-purificación para purificar grandes cantidades de muestras con una resolución decente, mientras que la meta de la HPLC preparativa es conseguir la resolución máxima (pureza) cuando las capacidades de carga son inferiores.  

Por tanto, las dos técnicas de cromatografía difieren en el material usado para la fase estacionaria (tamaño de partícula diferente), la dimensión del cartucho o la columna (diámetro interno [D.I.] y longitudes) y el caudal de la fase móvil, como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. Diferencias entre la cromatografía flash y la HPLC preparativa 
 

Cromatografía flash 

HPLC preparativa 

Tamaño de partícula 

15 – 63 µm

5 – 15 µm

ID de columna 

12 – 115 mm

10 – 70 mm

Caudal

15 – 250 ml/min

5 – 100 ml/min

Capacidad de carga 

< 300 g

< 10 g

Presión máxima 

50 bares

300 bares